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酶聯(lián)免疫試劑盒試驗中對于各項條件的選擇
點擊次數(shù):1119 更新時間:2018-12-06
   酶聯(lián)免疫試劑盒試驗中對于各項條件的選擇
  酶聯(lián)免疫試劑盒的基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面,使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行,用洗滌法將液相中的游離成分洗除,常用的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)法有雙抗體夾心法和間接法,前者用于檢測大分子抗原,后者用于測定特異抗體。
  在ELISA中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
  1、固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:elisa試劑盒用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
  2、包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18~24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml。
  3、酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。elisa試劑盒然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
  4、酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,elisa試劑盒尤其是H2O2在臨用前加入。
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